تراریختی گیاه ذرت با ژن ‭DREB1A ‬جهت افزایش مقاومت به تنش های غیرزیستی (خشکی، سرما و شوری)

در این پژوهش تلاش شد تا با استفاده از ژنص کلیدی تنظیمی (فاکتور رونویسی ‭DREB‬1‭A) ‬تراریختی گیاه ذرت با هدف افزایش تحمل به تنشصهای غیرزیستی محقق شود. به منظور بهینهصسازی کشت بافت گیاه ذرت از چند لاین تجاری استفاده شد. نتایج حاصل از بررسی کشت بافت جنینصهای نارس نشان داد که دو لاین A‮‭188‬ و S‮‭61‬ بترتیب با ‮‭92‬ و ‮‭86‬ درصد بیشترین میزان باززایی را دارند. به همین دلیل به عنوان لاینصهای مناسب برای انتقال ژن پیشنهاد شدند. نتایج حاصل از بررسی بهینهصسازی کشت بافت با ریزنمونه جنین رسیده نشان داد که در محیط حاوی 4 میلیصگرم در لیتر ،‮‭42‬‭-D ‬بیش از ‮‭93‬ ریزنمونهصها، کالوسصهای اولیه تولید کردند. کالوسصهای اولیه سپس به محیط کشت حاوی 2 میلیصگرم در لیتر،‮‭42‬‭-D ‬وغلظتصهای مختلف بنزیل آمینو پورین ‭(BAP) ‬و تیدیازرون ‭(TDZ) ‬و نیترات نقره انتقال داده شدند. بهترین تیمار‮‭0/2‬ میلیصگرم در لیتر ‭TDZ ‬با ‮‭10‬ میلیصگرم در لیتر نیترات نقره و میزان باززایی از کالوسصهای جنینصزا در این تیمار بین ‮‭18/3-40/25‬ درصد درلاینصهای مختلف بود. با افزایش میزان باززایی جنینصهای رسیده، استفاده از آن در روشصهای انتقال ژن به گیاه امکانصپذیر شد. به موازات بهینهصسازی کشت بافت، بهینهصسازی انتقال ژن با روش اگروباکتریوم به عنوان یک روش انتخابی انجام شد. در تیمار جنین کامل نارس در اندازه‮‭2-3‬ میلیصمتر لاین اینبرد S‮‭61‬ با محیط پیشصتیمار وآلودهصسازی با سویه ‭LBA‬‮‭4404‬ اگروباکتریوم و کنترل آن با آنتیصبیوتیک تایمنتین فراوانی تراریزش‮‭6/45‬ درصد به دست آمد. در بررسی بیان ژن ‭gus ‬از طریق رنگ آمیزی ‭X-Gluc ‬تظاهر موقت ژن ‭gus ‬تایید شد. ارزیابی گیاهان تراریخته احتمالی با آغازگرهای اختصاصی ژن ‭gus ‬و ‭bar ‬در آزمون ‭PCR ‬حضور این ژنصها را نشان داد. نتایج حاصل از یک آزمایش تکمیلی نشان داد که استفاده از تیمارهای حرارتی و سانتریفیوژ، انتقال ژن به B‮‭73‬ را بهبود میصدهد. همچنین افزودن‭DTT ‬و F‮‭68‬ به محیط همصکشتی افزایش انتقال ژن (تا میزان ‮‭18‬ درصد) را نشان داد. بنابراین این روش بهینه شده برای انتقال ژن ‭DREB‬1‭A ‬به گیاه ذرت مورد استفاده قرار گرفت. در تراریختی گیاه ذرت با ژن ‭DREB‬1‭A ‬از پیشبر القایی ‭rd‬‮‭29‬‭A ‬استفاده شد. این پیشبر از گیاه آرابیدوپسیس جدا شد و به منظور بررسی القاصپذیری آن جایگزین پیشبر ‭CaMV‬‮‭35‬‭S ‬در ناقل دوگاته ‭pBI‬‮‭121‬ گردید ناقل حاصل ‭(pBI-Rd-GUS) ‬به همراه ‭pBI‬‮‭121‬ برای تراریختی گیاه توتون مورد استفاده قرار گرفت. گیاهان تراریخته حاصل پس از ارزیابی مولکولی جهت تایید تراریختی با استفاده از تنشصهای غیر زیستی مانند شوری، خشکی، سرما، گرما و ‭ABA ‬تیمار شدند. نتایج حاصل القاصپذیری این پیشبر را ثابت نمود. به منظور انتقال ژن ‭DREB‬1‭A ‬موثر در تحمل به تنشصهای غیرزنده به گیاه ذرت، ابتدا ژن ‭DREB‬1‭A (pCRDREB)‬در ناقل بیانی ‭pCAMBIA‬‮‭3300‬ در مکان همولوگ و تحت پیشبر ‭Rd‬‮‭29‬‭A ‬قرار گرفت. ناقل جدید ‭pCA-RD-DREB ‬نامیده شد. با جایگزینی پیشبر ‭Rd‬‮‭29‬‭A ‬با پیشبر ‭CaMV‬‮‭35‬‭S ‬سازه ژنی ‭CaMV‬‮‭35‬‭S-DREB ‬هم شبر مورد استفاده قرار گرفت. انتقال ژن ‭DREB‬1‭A ‬به گیاه ذرت با استفاده از اگروباکتریوم صورت گرفت. آنالیزهای مولکولی با استفاده از ‭PCR‬، وجود ژن ‭DREB‬1‭A ‬و ‭bar ‬را در گیاهان تراریخته احتمالی تایید نمود. به منظور انتقال ژن با استفاده از تفنگ ژنی، جنینصهای نارس به طول 1 الی 2 میلی متر استخراج گردید و به مدت چهار روز بر روی محیط پیشصتیمار N6‭P)) ‬قرار داده شد. 3 ساعت قبل از بمباران جنینصها به محیط اسمزی ‭(N‬6‭Y) ‬انتقال داده شد. ژن ‭DREB‬1‭A ‬به سلولصهای بافت هدف با استفاده از دستگاه تفنگ ژنی شلیک شد. سپس جنینصها یک هفته در محیط استراحت N6‭Rest)) ‬و بعد به محیط انتخابی حاوی علفصکش ‭PPT (N‬6‭ppt) ‬منتقل گردیدند. کالوسصهای مقاوم به محیط رسیدگی، باززایی و گیاهچهصها به محیط ریشهصزایی منتقل شدند. در نهایت استخراج ‭DNA ‬ژنومی از گیاهان حاصل صورت گرفت. تراریختی گیاه ذرت و حضور ژن ‭bar (‬مقاوم به علفصکش) و ژن ‭DREB‬1‭A (‬متحمل به تنشصهای غیرزنده) با انجام ‭PCR ‬و آغازگرهای اختصاصی ژن ‭bar ‬و ‭DREB‬1‭A ‬تایید شد. حضور حداقل یک نسخه از ژن ‭DREB‬1‭A ‬گیاهان تراریخته احتمالی با استفاده از روشصهای مولکولی سادرن مورد تایید قرار گرفته، بذرهای حاصل به منظور دستیابی به نسل دوم کشت شدند. گیاهان تراریخته نسل T1 هم با استفاده از روش ‭PCR ‬بررسی شده و حضور ژن ‭DREB‬1‭A ‬در 2 گیاه مورد تایید قرار گرفت. طبق پیش بینی طرح حاضر دستیابی به گیاه نسل T2 و انجام آزمایشصهای فیزیولوژیکی تحمل به تنشصها در قالب طرحی دیگر انجام خواهد شد. کلمات کلیدی: اگروباکتریوم، ‭DREB‬1‭A ‬، تفنگ ژنی، تنشصهای غیرزیستی، ‭RD‬‮‭29‬A، ذرت