ایجاد جهش نقطه ای در اسید آمینه ۲۶۳ ژن استرپتوکیناز و کلونینگ و بیان پروتئین جهش یافته حاوی سیستئین

استرپتوکیناز یکی از شناخته ­شده ­ترین عوامل ترومبولیتیک با مصرف بالینی گسترده است. با وجود این، کاربرد آن به­ دلیل ایمونوژن بودن، ایجاد عوارض هموراژیک و نیمه­عمر نسبتا کوتاه، همراه با خطرهایی است. پگیلاسیون اختصاصی بر روی اسیدآمینه سیستئین، تکنیکی مفید جهت کاهش بسیاری از این عوارض است. هدف از مطالعه حاضر، طراحی و تولید مولکول استرپتوکیناز جهش ­یافته حاوی سیستئین است که برای پگیلاسیون اختصاصی قابل­ استفاده باشد. اسیدگلوتامیک ۲۶۳ استرپتوکیناز، که یک اسیدآمینه سطحی در ساختار پروتئین استرپتوکیناز است، برای انجام جهش و تعویض با سیستئین انتخاب­شد. برای نیل به این هدف، با به­ کارگیری روش SOEing PCR، جهش بر روی کدون GLU۲۶۳ ژن استرپتوکیناز برای تبدیل به کدون سیستئین انجام شد. سپس، ژن استرپتوکیناز دست ­نخورده و جهش­ یافته در وکتور بیانی pET-۲۶b (+) وارد شدند. ساختارهای حاصل درون اشریشیا کلی Rosetta (DE۳) ترنسفرم شده و توسط القا با IPTG بیان شدند. درنهایت، تولید پروتئین­ ها به­ وسیله آزمون­ های   SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ تایید شد. پروتئین­ ها به­ وسیله افینیتی کروماتوگرافی با ستون Ni-NTA agarose در شرایط دناتوره با اوره تخلیص شدند و برای حذف اوره و تاخوردگی مجدد پروتئین­ ها از فیلتراسیون ژلی با سفادکس  G-۲۵استفاده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که با استفاده از وکتور و میزبان مذکور ژن جهش­ یافته حاوی کدون سیستئین به­ خوبی بیان می ­شود و برای پگیلاسیون اختصاصی مناسب خواهد بود.

Keywords:

thrombolytic , PEGylation , glutamic acid , purification , ترومبولیتیک , پگیلاسیون , اسید گلوتامیک , تخلیص