توسعه روش Real-Time RT-PCR برای تشخیص بیماری پانکراس ماهی آزاد(SPDV)

عامل بیماری پانکراس ماهی آزاد برای اولین بار در سال 1984 در ماهیان آزاد اسکاتلند شناسایی گردید. بیماری منجر به تلفات تا بالای 50% در ماهیان آزاد می گردد. روشهای مختلفی برای تشخیص spdv وجود دارد که از آنجمله می توان به conventional RT-PCR, nested PCR IFT، VN اشاره کرد که هر کدام در تشخیص ویروس دارای محدودیتهای خاصی می باشند. از بین روشهای فوق هر چند روش conventional RT-PCR, nested PCR از حساسیت نسبتاً خوبی برخوردار است ولی قادر به اندازه گیری کمی میزان ویروس نمی باشد. در این پژوهش ما برای اولین بار توانستیم روش real-time RT-PCR را برای تشخیص ویروس spdv در ماهی آزاد توسعه داده و در تشخیص ویروس در نمونه های بیولوژیک بکار بردیم. ابتدا چهار جفت پرایمر برای قطعه nsp4 ویروس که بیشترین تشابه را بین سویه های مختلف دارا بود به ترتیب وزنهای مولکولی 331 ، 284، 226، 136 طراحی گردید سپس پروفایل شیمیایی و دمایی برای هر جفت از پرایمرها با استفاده از یک سیستم چک بورد استاندارد گردید. برای استاندارد کردن روش ابتدا رقتهای بین 1- تا 10- از ویروس رفرنس تهیه گردید سپس از هر رقت سه استخراج RNA با کیت Qiamap انجام گردید و با کیت Greensybr نمونه ها در ماشین ریال تایم RT-PCR انجام گردید. نتایج آماری r² value بین رقتها معادل 0/988 و اختلاف Ct بین هر رقت برابر 3/2- نشاندهنده کارایی بسیار خوب برای واکنش real-time بود. حساسیت روش فوق در مقایسه با روش conventional RT-PCR، 100 برابر بیشتر بود. سرعت بالا در تشخیص، اندازه گیری کمی و تعیین میزان کپی های ژن مورد مطالعه در نمونه های بیولوژیک و از سویی عدم نیاز به ژل داکیومنت از مزایای تشخیص با روش real-time RT-PCR می باشد که از آن می توان در مطالعات اپیدمیولوژی مولکولی، بیماری زایی میکروارگانیسم ها و بر هم کنش ویروس - میزبان بهره جست.