تولید فرآورده های دارویی در ریزجلبک های سبز

ریزجلبک ها ‭(Microalgea) ‬شامل گروه متنوعی از موجودات یو کاریوت با اهمیت فوق العاده از نظر اکولوژیکی میباشند. جنس ‭Dunaliella ‬گروهی از جلبک های سبز تک سلولی متحرک میباشند که دارای بیشترین قابلیت رشد در میان موجودات یوکاریوت به شرایط شوری هستند بنحوی که میتوانند تا شرایط اشباع نمک رشد نمایند. مزیت های متعدد ریزجلبک ها سبب گردیده تا بتوان از آنها بعنوان یک کارخانه سلولی سبز جهت تولید فرآورده های ارزشمند دارویی از قبیل واکسنها، هورمونها، فاکتورهای رشد، آنتی بادی های مونوکلونال و سایر پروتیینهای نوترکیب استفاده نمود. دراین تحقیق قابلیت استفاده از ریز جلبک دونالیلا برای تولید و بیان واکسن هپاتیت ب و همچنین پروتیین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی ‭(tPA) ‬مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور و با توجه به وجود موانع متعدد در انتقال ژن خارجی به ریز جلبک ها، ابتدا فرایند های کشت سلولی، آزمون حساسیت و انتقال ژن گزارشگر صورت گرفت و در ادامه انتقال ژن های هدف، زیر واحد کوچک آنتی ژن سطحی ‭HBsAg ‬و پروتیین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی ‭(tPA)‬، به ریزجلبک ‭Dunaliella salina ‬صورت پذیرفت. در خصوص بهینه سازی فرایند انتقال ژن، اولین قدم و به منظور استفاده از نشانگرهای انتخابی در فرآیند انتقال ژن، آزمون تعیین میزان حساسیت به ترکیبات بازدارنده ی رشد از قبیل کانامایسین، هیگرومایسین، کلرامفنیکل و فسفینوتریسین انجام گردید. نتایج این آزمون حاکی از حساسیت ریز جلبک دونالیلا سالینا به فسفینوتریسین در غلظت 7 میکروگرم در میلی لیتر بود. بنابراین ژن ‭bar‬، کدکننده ی پروتیین فسفینوتریسین ترانسفراز، به عنوان ژن انتخابگر برای فرایند انتقال ژن به این ریزجلبک معرفی گردید. برای انتقال ژن از روشهای همزدن با ذرات شیشه، الکتروپوریشن و بمباران با تفنگ ژنی استفاده شد. جهت انتقال ژن واکسن هپاتیت ب، ابتدا با استفاده از بانک های اطلاعاتی ناحیه کد کننده زیر واحد کوچک آنتی ژن سطحی ‭HBsAg ‬مشخص گردیده و ژن تولید کننده مربوطه جهت بیان مناسب در سیتم سلولی جلبک ‭D. salina ‬بهینه سازی و بصورت مصنوعی ساخته گردید. ترادف فوق در ابتدا به توسط هضم آنزیمی از وکتور همسانه ساز ‭pMK ‬جدا و با سایت های مشابه در وکتور ‭pBI‬‮‭121‬ جایگیری و جایگزین ژن ‭GUS ‬گردید. با توجه به حساسیت این ریز جلبک به علف کش باستا از ناقل بیانی ‭pCAMBIA‬‮‭3300‬ ، که حاوی ژن انتخابگر ‭bar ‬میباشد جهت بیان ژن خارجی در ریز جلبک استفاده گردید. جهت همسانه سازی در وکتور بیانی ‭pCAMBIA‬‮‭3300‬، ژن آنتی ژن سطحی به همراه پیشبرنده ‮‭35‬‭S ‬ویروس موزاییک کلم و خاتمه دهنده ‭NOS ‬با استفاده از هضم آنزیمی از ناقل اولیه جدا گردیده و اتصال مجدد قطعات مربوطه در ناقل بیانی ‭pCAMBIA‬‮‭3300‬ صورت پذیرفت. تایید مراحل مختلف همسانه سازی با استفاده از آزمون های ‭PCR ‬، هضم آنزیمی و تعیین ترادف صورت گرفت. انتقال ژن به جلبک ‭D. salina ‬با استفاده از روشهای همزدن با ذرات شیشه و بمباران با تفنگ ژنی صورت پذیرفت. جلبک های تراریخته بر روی محیط کشت انتخابی حاوی علف کش باستا قرار گرفته و پس از تکثیر سلول های تراریخته مقاوم به علف کش آزمون های تکمیلی مولکولی صورت پذیرفت. نتایج آزمون های ‭PCR ‬و ‭RT_PCR ‬حاکی از حضور و بیان ژن خارجی در ریزجلبک های مقاوم به علف کش بود. جهت تولید پروتیین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی ‭tPA‬، از وکتور ‭pCAMBIA‬‮‭3301‬ و همچنین ‭ptGBC-Ubi ‬برای انتقال ژن به ریز جلبک استفاده گردید. پس از طراحی و ساخت سازه های بیانی، ترانسفورماسیون از روش استفاده از ذرات شیشه به داخل سلول های ریزجلبک صورت گرفت. بررسی تولید پروتیین نوترکیب از طریق روش های ‭ELISA‬، وسترن بلات و آزمون زیست سنجی مورد مطالعه قرار گرفت که نهایتا غلظت ‭t-PA ‬در کل پروتیین های محلول ‭(TSP) ‬به طور متوسط ‮‭102.0‬ ‭g/mg ‬تعیین گردید. نمونه های تراریخته مثبت در محیط مایع غیر انتخابی رشد داده شدند، بطوریکه بیان ‭t-PA ‬به صورت پایدار تا ‮‭50‬ نسل و در محیطی عاری از ‭BASTA ‬حفظ گردید. کلمات کلیدی: کشاورزی مولکولی، آنتی ژن سطحی هپاتیت B، ریز جلبک دونالیلا سالینا، انتقال ژن، پروتیین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی