کلونینگ، بیان ژن و خالص سازی آنزیم کربوکسی پپتیداز از سویه Bacillus Halodurans

پروتئازهای میکروبی بدلیل کاربرد گسترده در صنایع شوینده، دارویی ، فرآوری خوراک دام درصد بالایی از کل بازار آنزیمهای صنعتی را به خود اختصاص میدهند. سویه های جنس باسیلوس، قابلیت بالایی در تولید و ترشح مقادیر بالای آنزیم های پروتئاز را دارند که ناشی از فعالیتهای فیزیولوژیک آنها میباشد. در این تحقیق پروتئاز Carboxypeptidase از باکتری Bacillus halodurans بیان و خالص شد. ابتدا ژن کدکننده کربوکسی پپتیداز از سویه ی Bacillus halodurans بوسیله PCR و با استفاده از پرایمرهای دارای سایت برش NdeI و BamHI جدا گردید. سپس بر روی محصولPCR هضم آنزیمی صورت گرفت و در بین سایت های موردنظر در وکتور بیانی pET۲۸a+ کلون گردید و پلاسمید نوترکیب به داخل سویه بیانی E.coli BL۲۱ ترانسفورم شد. پلاسمیدهای تایید شده از طریق Colony PCR برای تعیین توالی ارسال گردید و حضور ژن تایید شد. سپس بیان تحت شرایط بیانی مختلف بهینه گردید و تخلیص پروتئین مورد نظر از طریق کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز انجام گردید. بیشترین سطح بیان در غلظت ۰/۲ میلی مولار IPTG و دمای ۲۸ درجه سانتیگراد و مدت زمان ۲۰ ساعت انکوباسیون تعیین شد. الکتروفورز پروتئین نشان داد که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب کربوکسی پپتیداز حدود ۵۵ کیلودالتون میباشد. با توجه به بهینه سازی آسان و بیان نوترکیب به مقدار قابل توجه در سیستم E.coli می توان امیدوار بود که پروتئاز های با منشاء سویه های باکتریایی بومی ایران و از جمله کروبوکسی پپتیدازهای منشاء گرفته از این سویه ها، پتانسیل بالایی در تبدیل شدن به آنزیمهای با کاربرد صنعتی دارند. در ادامه مراحل تحقیق حاضر در فاز دوم که شامل سنجش فعالیت آنزیم بدست آمده در شرایط مختلف دمایی، غلظت نمک و pH می باشد در صورت حصول نتایج رقابتی با آنزیمهای تجاری موجود، امکان معرفی آنزیم بدست آمده به عنوان کاندید مناسب برای کاربرد صنعتی وجود دارد.

Keywords:

نوترکیب , پروتئاز , pET۲۸a+