جداسازی و شناسایی مولکولی گونه های باسیلوس اندوفیت ریشه درختان کچف در استان های مازندران و سمنان

چکیده مبسوط مقدمه و هدف: گونه ­های باسیلوس (Bacillus spp.) اندوفیت به دلیل ویژگی­ های سودمند زیستی بیشتر از دیگر جنس ­های باکتریایی در تحقیقات با هدف کنترل زیستی مورد استفاده قرار می­ گیرند. از آنجایی ­که حفظ تنوع­ زیستی و پایداری جنگل هیرکانی از اهمیت ویژه­ ای در مدیریت این بوم­ سامانه حیاتی برخوردار است شناسایی و مطالعه باکتری­ های مفید و حفاظت­ کننده از گیاهان می­ تواند در برنامه­ های محافظت ­از گونه­ های گیاهی ارزشمند موجود در آن نقش بسزایی ایفا ­نماید. این تحقیق با هدف شناسایی جدایه­ های باسیلوس اندوفیت ریشه درختان کچف (Carpinus orientalis Mill.) و تعیین ویژگی­ های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی آنها در شرایط آزمایشگاهی انجام گرفت. مواد و روش­ ها: برای جداسازی اندوفیت­ های باکتریایی، نمونه ­برداری تصادفی از ریشه­ درختان کچف ارتفاعات بالابند نوار مرزی استان ­های مازندران و سمنان (کوه­ های نواحی جنوبی مازندران و نوار باریک شمال سمنان) در بهار ۱۳۹۷ انجام شد. سوسپانسیون ریشه­ های ضدعفونی و سپس خرد شده در آب مقطر در محیط­ کشت­ Tryptic soy agar کشت شد. نقوش پروتئین­ های کل سلولی با الکتروفورز در ژل پلی­اکریل­آمید (Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis)، تعیین ویژگی­ های فنوتیپی جدایه ­ها و استفاده از نشانگرهای مولکولی IS۵۰ و BOX و REP به منظور گروه بندی جدایه­ ها و وجود تنوع در آنها مورد بررسی قرار گرفت. یک نماینده از جدایه­ های هر گروه انتخاب شده و برای شناسایی مولکولی با بکارگیری آغازگرهای عمومی f۲۷ و r۱۴۹۲ قطعه ۱۵۰۰ جفت­ باز ناحیه S rDNA۱۶ با PCR تکثیر شد. پس از خالص ­سازی قطعه تکثیر شده برای تعیین ترادف به شرکت Microsynth سوئیس ارسال شد. ترادف­ های بدست آمده با ترادف­های موجود در بانک ژن NCBI به روش BLASTn مقایسه شد. توانایی جدایه­ ها در تولید سیانید هیدروژن، هورمون IAA، پروتئاز و بیوفیلم نیز ارزیابی شد. یافته ­ها: سی جدایه باسیلوس از ریشه­ های درختان مناطق مختلف در محیط کشت باکتریایی جدا و خالص شدند. بر اساس ویژگی­ های بیوشیمیایی و مولکولی، جدایه­ های باسیلوس حداقل در چهار گروه متفاوت قرار گرفتند. مقایسه ترادف ناحیه تکثیر شده از S rDNA۱۶ با ترادف ­های موجود در ژن­ بانک NCBI و ترسیم درخت فیلوژنتیکی با الگوریتم Maximum-Likelihood نشان­ دهنده وجود گونه ­های Bacillus thuringiensis،B. cereus، B. subtilis و B. velezensis در نمونه­ ها بود. گونه ­ی B. thuringiensis به عنوان گونه غالب و B. subtilis به عنوان گونه­ ی پرجمعیت شناسایی گردید. هورمون IAA تولیدی جدایه­ ها بین ۵ تا ۸۵ میلی گرم در لیتر متغیر بود که بیشترین مقدار آن مربوط به جدایه­ های گروه B. thuringiensis و کمترین مقدار آن مربوط به جدایه ­های گروه B. velezensis بود. اکثر جدایه­ ها توانایی تولید آنزیم ­های لیپاز، ژلاتیناز، لسیتیناز، پروتئاز و آمیلاز را داشتند. جدایه­ های B. cereus و B. thuringiensis به مقدار قابل توجهی پروتئاز تولید کردند. بیشترین مقدار بیوفیلم توسط جدایه ­های گروه B. velezensis تولید شد. نتیجه­ گیری: توانایی بالقوه و وجود تنوع در ویژگی­ های سودمند فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه ­های باسیلوس اندوفیت ریشه کچف نشان داد که آنها  می­ توانند به عنوان منابع مناس افزاینده رشد گیاهان و کنترل زیستی مورد توجه قرار گیرند. این ویژگی ­ها در گونه­ های B. thuringiensis و B. cereus قابل ملاحظه بود. پژوهش حاضر اولین بررسی در زمینه شناسایی و تعیین ویژگی­ های بیوشیمیایی و سودمند زیستی جدایه­ های باسیلوس اندوفیت ریشه کچف در ایران می­باشد.

Keywords:

Bacillus , Endophyte , IAA , Isolate , Oriental hornbeam , Sequences , اندوفیت , ایندول استیک اسید , باسیلوس , ترادف , جدایه , کچف