همسانه سازی و بیان ژن پروتیین پوششی جدایه ایرانی ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (ACLSV) در باکتری E. coli

ویروس لکهبرگی کلروتیک سیب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) یکی از ویروسهای مهم درختان میوه دانه دار و هسته دار میباشد که گسترش جهانی دارد. هدف از این مطالعه، ساخت سازه بیانی و سپس بیان ژن پروتیین پوششی (Coat Protein (CP)) ویروس لکه برگی کلروتیک سیب در باکتری Escherichia coli میباشد. بیان پروتیین پوششی در سیستم پروکاریوتی، نیاز به خالص سازی ویروس از گیاه میزبان را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع میسازد. به منظور تولید پروتیین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و با آغازگرهای اختصاصیACLSV-MF وACLSV-MR ژن کامل پروتیین پوششی به طول 582 جفت باز تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه سازی pTG19 متصل و به باکتری E. coli سویه DH5 منتقل شد. باکتریهای تراریخت شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی سیلین، X-Gal و IPTG غربال و به روش تجزیه قلیایی استخراج گردیدند. این ژن در پلاسمید استخراج شده با آنزیمهای BamHI و XhoI که محل اثر آنها در آغازگرها قرار داده شده بودند، برش و به حامل بیان(pET28a(+ که با همین دو آنزیم برش داده شده بودند، اتصال داده شد. pET28a (+) حاوی ژن CP ویروس در باکتری E. coli سویه BL21(DE3) ترانسفورم و سپس القاء بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت در الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید حاوی سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتیین حدود 26 کیلودالتونی مربوط به ژن پروتیین پوششی ویروس مذکور بود. بیان این پروتیین میتواند برای تولید آنتی بادی بر علیه ACLSV مورد استفاده قرار گیرد.

Keywords:

آنتی بادی , الکتروفورز , بیان , پروتیین نوترکیب , همسانه سازی