جداسازی، خالص سازی و تعیین هویت فراکسیون ضد انعقاد موجود در زهر مار افعی قفقازی ‭Agkistrodon Halys ‬بومی ایران

آنزیمهای سرین پروتیاز یکی از مهمترین ترکیبات موجود در زهر مارهای متعلق به خانواده افعی ها را تشکیل می دهند. بسیاری از عوامل ضد انعقادی و انعقادی در زهر مارها از این نو ع آنزیمها هستند. جداسازی ترکیبات انعقادی و ضد انعقادی و شناسایی آنها در زهر مارهای متعلق به خانواده افعی ها از مهمترین شاخصه ها جهت استاندارد کردن و تشخیص زهر این گونه از مارها می باشد. در تحقیق حاضر تخلیص پروتیینهای ضد انعقادی به توسط ژل فیلتراسیون ، کروماتوگرافی تبادل یونی و ‭HPLC ‬انجام گرفت . همچنین این این آنزیمها توسط الکتروفورز مورد ارزیابی قرار گرفتند و وزن مولکولی آنها تعیین گردید. خصوصیت هر پروتیین خالص شده با روشهای انحصاری تعیین شد. جهت تعیین خصوصیت هر فراکسیون و زیر فراکسیون و نهایتا پپتید خالص شده از آزمایش ‭PT ‬استفاده گردید. آنزیمهای تخلیص شده ‮‭143‬‭AH ‬و ‮‭144‬‭AH ‬بر روی پلاسما اثر انعقادی داشتند و الکتروفورز وزن آنها را در حدود ‭Da‬‮‭32000‬ و ‮‭30500‬ تعیین شدند. با توجه به آزمایشات انجام گرفته هر دوی این آنزیمها بر روی ‭BAPNA ‬تاثیر داشته بنابراین سرین پروتیاز می باشند؛ ولیکن از آنجا که توسط هپارین بازدارندگی نشده و برای فعالیت نیاز به هیچ کوفاکتوری ندارند و بر روی پلاسما نیز تاثیر انعقادی دارند و با توجه به وزن ملکولیشان بنظر می رسد که این آنزیمها در دسته آنزیمهای شبه ترومبین قرار بگیرند. الکتروفورز وزن ملکولی فاکتور ضد انعقادی تخلیص شده را در حدود ‭kDa‬‮‭22000‬ تعیین نمود و دستگاه ‭HPLC ‬خلوص %‮‭92‬ آن را تایید نمود. این فاکتور موجب تاخیر در زمان تست ‭pt ‬شد. با توجه به آزمایشات انجام گرفته فاکتور ضد انعقادی تخلیص شده بر روی ‭BAPNA ‬که سوبسترای اختصاصی سرین پروتیازهاست هیچ تاثیری نداشت بنابراین در این گروه آنزیمی قرار نمی گیرد. همچنین، این فاکتور بر روی کازیین و پلاسما که حاوی فیبرینوژن است نیز تاثیری نداشت بنابراین بنظر می رسد که بطور کلی پروتیاز نباشد. از نتایج بدست آمده بنظر می رسد که این پروتیین باید یکی از دو نوع پروتیینهای غیر آنزیمی باشد.