تولید و خالص سازی توکسین بتا از کلستریدیوم پرفرنجنس تایپ ‭C ‬با روش کروماتوگرافی

باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ ‭C ‬در بره ها، گوساله ها، کره اسبها، بچه خوکها و جوجه ها باعث ایجاد بیماری انتروتوکسمی می شود. همچنین در انسان، عامل بیماری ‭enteritis necroticans ‬یا ‭pigbel ‬می باشد. مهمترین توکسین تیپ ‭C ‬توکسین بتا است. این توکسین مهمترین فاکتور ویرولانس باکتری کلستریدیوم پر فرنجنس تیپ ‭C ‬در بیماریزایی این جرم می باشد. در این طرح تحقیقاتی عملیات خالص سازی توکسین بتا با استفاده از تکنیکهای مختلف کروماتوگرافی نظیر کروماتوگرافی تعویض کاتیونی‭CM-Sepharose ‬، کروماتوگرافی تعویض آنیونی ‭DEAE-Cellulose ‬و ژل فیلتراسیون ‭Sephadex-G‬‮‭100‬ انجام شد. پس از کشت باکتریایی، ‭MLD ‬نمونه حاصل از کشت باعث مرگ موشها تا رقت ‮‭1/2000‬ شد. همچنین نمونه کشت اولیه باعث مرگ سلولهای ‭HUVEC ‬در کشت سلولی شد. بهترین غلظت نمک آمونیوم سولفات جهت ترسیب و تغلیظ نمونه کشت باکتریایی %‮‭50‬ تعیین شد. پس از عملیات ترسیب، تغلیظ و دیالیز، نمونه خام بر روی ستون کروماتوگرافی تعویض کاتیونی‭CM-Sepharose ‬بارگذاری شد و اولین فراکسیون حاصل از این مرحله بر روی کروماتوگرافی تعویض آنیونی ‭DEAE-Cellulose ‬بارگذاری شد. توکسین بتا در غلظت نمک ‮‭100‬ میلی مولار خارج گردید. پس از ارزیابی فراکسیون به دست امده توسط ‭SDS-PAGE ‬و بررسی میزان فعالیت توکسین توسط تستهای ‭MLD ‬و ‭MTT assay ‬بر روی ستون ‭Sephadex-G‬‮‭100‬ بارگذاری شد. نهایتا فراکسیونی که دارای توکسین بتای خالص بود شناسایی و مورد آنالیز قرار گرفت. بر اساس نتایج ‭SDS-PAGE‬، توکسین به دست آمده از خلوص بالایی برخوردار بود. توکسین بتا بر اساس فعالیت توکسین در مراحل مختلف خالص سازی حدود ‮‭77/8‬ برابر خالص شد توکسین به دست آمده دارای میزان پروتیین‮‭12/0‬ ‭mg/ml ‬، فعالیت اختصاصی ‮‭8333‬ بود. نتایج وسترن بلات دلالت بر وجود توکسین بتای فعال در فراکسیون به دست آمده داشت. همچنین نتایج الایزا نشان داد که میزان فعالیت اختصاصی توکسین بتا در مراحل مختلف خالص سازی افزایش یافته است. وزن مولکولی این توکسین حدود ‮‭37‬ کیلو دالتون تعیین گردید‭. LD‬‮‭50‬ توکسین بتا حدود‮‭21.2‬ ‭kg /g ‬تعیین گردید. این توکسین نسبت به حرارت حساس بوده و میزان بسیار زیادی از فعالیت بیولوژیک خود را در دمای بالای ‮‭60‬ درجه از دست می دهد. فعالیت بیولوژیک توکسین بتا تا ‮‭30‬ درجه تغییری نشان نداد. ولی فعالیت توکسین بین دمای ‮‭30‬ تا ‮‭60‬ بتدریج کاهش محسوسی نشان داد. با توجه به یافته های این تحقیق، روشهای استفاده شده در عملیات خالص سازی این توکسین مناسب می باشد و توکسین به دست آمده دارای میزان فعالیت و درجه خلوص مناسبی می باشد. از این توکسین می توان در تهیه کیت های تشخیصی بهره گرفت. همچنین می توان از این توکسین جهت تولید آنتی توکسین بتا استفاده کرد. با توجه به خلوص بالا و فعالیت این توکسین می توان جهت مطالعات بررسی مکانیزم های بیماریزایی که در بالین بیمار بسیار حایز اهمیت است بهره برد. همچنین در زمینه داروهای با منشا زیستی، مطالعه اثرات درمانی این توکسین می تواند نگرش جدیدی در زمینه کاربرد توکسینهای کلستریدیایی ایجاد کند.