بررسی پایداری انزیم پراکسیداز گیاهی لیپیدیوم درابا در pH های مختلف

پراکسیدازها (EC ۱.۱۱..۱.۷) اکسیدوردوکتازهایی هستند که کاهش پراکسیدها مانند پراکسید هیدروژن (H۲O۲) و اکسیداسیون انواع ترکیبات آلی و غیرآلی را کاتالیز میکنند. بیشترین کاربردهای تجاری پراکسیدها در تشخیص های تحلیلی مانند حسگرهای زیستی و سنجش ایمنی میباشد. هدف اصلی در این تحقیق، بررسی پایداری آنزیم پراکسیداز گیاهی لیپیدیوم درابا (LDP) در حضور pH های مختلف میباشد. در این پژوهش، پس از کشت باکتری حاوی وکتور pET۲۸a که حامل ژن پراکسیداز گیاهی LDP میباشند با استفاده از القا کننده IPTG افزایش بیان به مدت ۴ ساعت در دمای ۱۸œC انجام گرفت. تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA، و با استفاده از بافر حاوی ایمیدازول انجام شد. خلوص پروتئین با استفاده از ژل الکتروفورزSDS-PAGE و غلظت آن با استفاده از روش برادفورد اندازه گیری و فعالیت آن در حضور سوبسترای TMB و H۲O۲ در طول موج ۶۵۳ نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد. سپس فعالیت آنزیم در pH مختلف (۹-۵) با سه بار تکرار اندازه گیری شد. نتایج حاصل از ژل الکتروفورز نشان داد که پروتئین با درجه خلوص بالا تخلیص شده و بیشترین فعالیت را در رنج ۶ pH تا ۶/۵ دارد و در pH های کمتر و همچنین pH های خنثی و بازی فعالیت آن کاهش مییابد. بنابراین پیشنهاد میشود جهت استفاده از این آنزیم در pHهای دیگر، از روشهایی مثل جهش زایی جهت افزایش پایداری آن استفاده شود.

Keywords:

اکسیدوردوکتاز , تخلیص , الکتروفورز