بهینه سازی کدونی و تولید آنزیم نوترکیب D-لاکتات دهیدروژناز

آنزیم لاکتات دهیدروژناز از خانواده اکسیدو -ردوکتازها بوده که در مرحله ی آخر گلیگولیز غیر هوازی، واکنش تبدیل لاکتات و NAD+ به پیروات و NADH را کاتالیز م کند.در انسان دو ایزومر از این آنزیم وجود دارد D-LDH و L-LDH فرم D بصورت معمول در بدن تولید نمی شود و به عنوان مارکر در تشخیص برخی بیماری ها مانند سنگ کلیه، نارسایی قلبی، برخی تومورها و آپاندیسیت کاربرد دارد. براین اساس طراحی و ساخت بیوسنسورهای اندازه گیری سطح اسید لاکتیک خون از اهمیت بالایی برخوردار است. در این تحقیق بهینه سازی کدونی 100 جفت باز ژن آنزیم D- لاکتات دهیدروژناز به همراه دم هیستیدینی در جایگاه برشی Xho1/ BamH1 انجام و در وکتور BL21 در داخل باکتری E. coli کلون شد. سپس باکتری های حاوی این پلاسمید در محیط کشت TB در دمای 37 درجه با چرخش rpm 250 رشد داده شدند. در ادامه، خالص سازی آنزیم با استفاده ازکروماتوگرافی تعویض یونی روی ستون نیکل -سفارز انجام شد. در نهایت با استفاده از کاهش جذب NADH در طول موج 340 نانومتر در حضور پیروات با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر، فعالیت ویژه ی این آنزیم محاسبه گردید. این تحقیق در حال حاضر یک رویکرد جدید از کلون سازی و بیان ژن بهینه سازی شده ونوترکیبD-LDH در سویه ی BL21 می باشد. با توجه به نتایج، از آنزیم D- لاکتات دهیدروژناز تولید شده توسط سویه ی BL21 می توان برای تولید انبوه و مقرون به صرفهی این آنزیم برای استفاده از کاربردهای فراوان آن استفاده کرد.

Keywords:

لاکتات دهیدروژناز , NADH , پیروات , بهینه سازی کدونی